Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
05.05.2009 um 23:47Ich esse Manna.
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Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
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Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
05.05.2009 um 23:48@T_K_V
kp^^Hier, viel Spaß beim lesen. :D
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium.
Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B12 indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L., 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin B12 erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin B12-Biosynthese sind 5'- Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B12) und Methylcobalamin (MeCbl), während Vitamin B12 per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin B12 einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle.
Die Spezies B. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von 2 × 5 µm, einem G+C-Gehalt von ca. 38% und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge an B. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in B. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an B. megaterium (Priest, F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporen-bildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer-negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von B. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z. B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann B. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Die Vorteile der breiten Anwendung von B. megaterium bei der industriellen Produktion verschiedenster Enzyme, Vitamine etc. sind vielfältig. Dazu gehört zum ersten sicherlich der Umstand, daß in B. megaterium transformierte Plasmide sich als sehr stabil erweisen. Dies muß in direktem Zusammenhang gesehen werden mit der mittlerweile etablierten Möglichkeit, diese Spezies beispielsweise durch Polyethylenglykolbehandlung zu transformieren. Dies war bis vor wenigen Jahren noch ein Haupthindernis der Anwendung von B. megaterium als Produktionsstamm. Parallel hierzu ist auch der Vorteil einer relativ gut entwickelten Genetik zu sehen, die innerhalb des Bacillus-Genus nur von B. subtilis übertroffen wird. Zweitens weist B. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß B. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezerniert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und β-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit B. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, bis eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels B. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von B. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß B. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird B. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von α- und β-Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin B12-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Aufgrund seiner vielfältigen Vorteile zum Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte ist der Einsatz von Bacillus megaterium wirtschaftlich sehr interessant.
Bei der industriellen Fermentation aerober Mikroorganismen treten jedoch im großtechnischen Maßstab regelmäßig Probleme, insbesondere bei der effizienten Sauerstoffdurchlüftung der Bakterienkulturen auf, die mit erheblichen Verlusten in der Produktausbeute verbunden sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Herstellung von Vitamin B12 mit Bacillus megaterium zu optimieren.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend Bacillus megaterium gelöst, bei welchem die Fermentation unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird.
Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung alle üblichen B. megaterium-Stämme eingesetzt werden, die als Vitamin B12-Produktionsstämme geeignet sind.
Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Bacillus megaterium-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894.
Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß B. megaterium zu einer anaeroben Lebensweise fähig ist und außerdem unter diesen Bedingungen die Vitamin B12 Produktion höher ist, als unter aeroben Bedingungen. Der Vergleich der Vitamin B12 Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen zeigt deutlich, daß die anaerobe Vitamin B12 Produktion bei allen untersuchten Stämmen gegenüber der aeroben Vitamin B12 Produktion wenigstens um den Faktor 3 bis 4 gesteigert ist. Weitere Steigerungen lassen sich durch eine systematische Optimierung der Wachstumsbedingungen und der Zusammensetzung des Kulturmediums sowie der eingesetzten Bakterienstämme erreichen.
Erfindungsgemäß kann die Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium beispielsweise dadurch gesteigert werden, daß dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. Auch der Zusatz von beispielsweise Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder deren Kombinationen wirkt sich vorteilhaft auf die Vitamin B12 Produktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus. Vorteilhaft können auch die zuvor genannten Verbindungen einzeln oder deren Kombinationen in Kombination mit Cobalt sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß auch ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, das dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. D. h. Cobalt kann beispielsweise einzeln oder in Kombination mit wenigstens Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder Kombinationen der zuletzt genannten Verbindungen zugesetzt werden.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Vitamin B-12 Gehalt durch die Zugabe von etwa 200 bis 750 µM, vorzugsweise 250 bis 500 µM Cobalt pro Liter Kulturmedium angehoben werden.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der zuvor genannten Art umfasst, bei dem B. megaterium zunächst aerob und anschließend anaerob fermentiert wird. In einer vorteilhaften Variante erfolgt der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der Mitte oder am Ende, bevorzugt am Ende, der exponentiellen Wachstumsphase der aerob wachsenden Zellen erfolgt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei ein Verfahren, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte, wenigstens jedoch eine optische Dichte von etwa 2 bis 3 erreicht hat.
Unter anaeroben Bedingungen, sowohl in dem einstufigen, als auch in dem zweistufigen erfindungsgemäßen Verfahren, sind im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. Der Zeitpunkt der Überführung in die Anaerobierflaschen erfolgt insbesondere bei dem zweistufigen Verfahren, sobald sich die aerob angezüchteten Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. D. h. nach der Überführung in die Anaerobierflaschen verbrauchen die Bakterien den dort vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semianaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt.
Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi-anaerobe Bedingungen einstellen.
In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden.
Generell ist für eine erfindungsgemäße Fermentation unter anaeroben Bedingungen (ob nun semi-anaerob oder strikt anaerob), eine aerobe Anzucht (Vorkultur) der Bakterien nicht zwingend erforderlich. D. h. die Bakterien können auch unter anaeroben Bedingungen angezüchtet werden und anschließend unter semianaeroben oder strikt anaeroben Bedingungen weiter fermentiert werden. Denkbar ist auch, daß das Inocculum direkt aus der Stammhaltung entnommen und zur Herstellung von Vitamin B12 unter anaeroben Bedingungen eingesetzt wird.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Fermentierung unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von etwa 250 µM Cobalt; unter anaeroben Bedingungen ist ein Zusatz von etwa 500 µM Cobalt vorteilhaft.
Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenese oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u. a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B-12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin B12-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechselflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z. B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die entsprechenden Nukleotidsequenzen, kodierend für die an der Biosynthese von Vitamin B12 beteiligten Enzyme. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch eine isolierte Nukleotidsequenz kodierend für die an der Biosynthese von Uroporphyrinogen III beteiligten Enzyme, organisiert in dem hemAXCDBL-Operon aus B. megaterium mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder deren Allele. Erfindungsgemäß sind auch die durch das hemAXCDBL-Operon aus B. megaterium kodierten Enzyme mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No. 2-6 sowie Isoenzyme oder modifizierte Formen davon umfaßt.
Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.
Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Genstruktur enthaltend die isolierte Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder Teile davon, sowie operativ damit verknüpfte Nukleotidsequenzen mit regulatorischer Funktion.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier das β-Galakosidase- oder Arabinose-System genannt.
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind.
Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Vektor enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder Teile davon oder eine Genstruktur der zuvor genannten Art, sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, Replikation in der Wirtszelle und/oder Integration in das Wirtszellgenom. Beispiele für solche zusätzlichen Sequenzen sind in der Literatur zahlreich beschrieben und werden nicht weiter ausgeführt.
Geeignete Systeme für die Transformationen und Überexpressionen der erwähnten Gene in B. megaterium sind beispielsweise die Plasmide pWH1510 und pWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320, die bei Rygus, T. et al. (1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599) beschrieben sind. Die Plasmide sind auch kommerziell erhältlich (Q-biogene und MoBiTec). Die genannten Systeme sind jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß ein Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen hemAXCDBL-Operon oder Teile davon verstärkt exprimiert wird/werden.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren umfasst, bei dem ein genetisch veränderter Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen hemAXCDBL-Operon oder Teile davon gegenüber dem genetisch nicht veränderten Bacillus in erhöhter Kopienzahl in der Zelle vorliegt/vorliegen. Die Anzahl der Kopien kann zwischen 2 bis mehrere hundert variieren.
Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern.
Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen und/oder im Chromosom integriert und/oder amplifiziert sein.
Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm zum Einsatz in ein Verfahren zur Vitamin-B12-Herstellung der zuvor genannten Art, der eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl der Nukleotidsequenz des hemAXCDBL-Operons oder Teile davon aufweist. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm, der in replizierender Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor erwähnten Art enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz des hemAXCDBL-Operons oder Teile davon oder der Genstruktur oder eines Vektors der zuvor genannten Art zur Herstellung eines transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor erwähnten Art. Die vorliegende Erfindung schießt auch die Verwendung des transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor genannte Art zur Herstellung von Vitamin B12 ein.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Sie wirken sich jedoch nicht limitierend auf die Erfindung aus. 1. Chemikalien und molekularbiologische Agenzien DNA-Isolations-Kit Qiagen
Fast-Link Ligation Kit Biozym
Molekularbiologische Enzyme Amersham-Pharmacia, NEN-LifeScience
Wachstumsmedien Difco
2. Bakterienstämme und Plasmide
Alle in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. K2HPO4 60.3 mM KH2PO4 33.1 mM (NH4)2SO4 7.6 mM Natriumcitrat 1.7 mM MgSO4 1.0 mM D-Glucose 10.1 mM Thiamin 3.0 µM Casaminoacids 0.025% (w/v)
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Mopso (pH 7.0) 50.0 mM Tricin (pH 7.0) 5.0 mM MgCl2 520.0 µM K2SO4 276.0 µM FeSO4 50.0 µM CaCl2 1.0 mM MnCl2 100.0 µM NaCl 50.0 mM KCl 10.0 mM K2HPO4 1.3 mM (NH4)6Mo7O24 30.0 pM H3BO3 4.0 nM CoCl2 300.0 pM CuSO4 100.0 pM ZnSO4 100.0 pM D-Glucose 20.2 mM NH4Cl 37.4 mM Titrationsreagenz war KOH-Lösung.
NaCl 8.6 mM Na2HPO4 33.7 mM KH2PO4 22.0 mM NH4Cl 18.7 mM D-Glucose 20.2 mM MgSO4 2.0 mM CaCl2 0.1 mM
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g/l, Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCl2 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
PEG 6000 40.0% (w/v) Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCl2 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
Saccharose 300.0 mM Mops (pH 7.3) 31.1 mM NaOH 15.0 mM L-Prolin 52.1 mM D-Glucose 50.5 mM K2SO4 1.3 mM MgCl2 × 6 H2O 45.3 mM KH2PO4 313.0 µM CaCl2 13.8 mM Agar-Agar 4.0 g/l, Casaminoacids 0.2 g/l Hefe-Extrakt 10.0 g/l Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
4. Medien und Medienzusätze 4.1 Medien
Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, gearbeitet.
4.2. Zusätze
Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren oder Antibiotika wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50°C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen, wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende:
Ampicillin 296 µM Tetracyclin 21 µM ALA 298 µM Häm 153 µM X-Gal 98 µM Methionin 335 µM Cystein 285 µM Natriumnitrat 10 mM Natriumnitrit 10 mM Dinatriumfumarat 10 mM Glucose 10 mM Ammoniumchlorid 37 mM Xylose 33 mM Lysozym 10 µg/ml Casaminoacids 0.025% (w/v)
5. Mikrobiologische Techniken 5.1. Sterilisation
Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für 20 min bei 120°C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert, Glaswaren mindestens 3 h bei 180°C hitzesterilisiert.
5.2. Allgemeine Wachstumsbedingungen
Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37°C und einer minimalen Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert.
5.3. Bedingungen für Bacillus megaterium Wachstum
Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und, falls nicht anders angegeben, bei 30°C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 100 ml in kleinen Anaerobenflaschen bei 30°C und 100 rpm fermentiert. In beiden Fällen wurde auf die Verwendung qualitativ konstanter Medien, Animpfung im Verhältnis 1 : 100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet.
5.4. Bestimmung der Zelldichte
Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, daß einer OD578 von eins eine Zellzahl von 1 × 109 Zellen entspricht.
5.5. Vergleichende Wachstumsuntersuchungen
Es wurden vergleichende Untersuchungen zum aeroben und anaroben Wachstumsverhalten verschiedener Bacillus megaterium-Stämme durchgeführt, die in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt sind. Bei den eingesetzten Stämmen handelt es sich um die Stämme B. megaterium DSMZ 32 (Wildtyp) oder die unter aeroben Bedingungen zur Vitamin B12-Produktion geeigneten "Produktionsstämme" DSMZ 509 und DSMZ 2894. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz dieser Stämme limitiert. Denkbar sind auch andere zur Herstellung von Vitamin B12 geeignete Stämme, eingeschlossen genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenesen oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können.
Bei den Untersuchungen, inwieweit B. megaterium zum anaeroben Wachstum befähigt ist, wurden anstelle des aeroben Elektronenakzeptors Sauerstoff, die alternativen Elektronenakzeptoren Nitrat, Nitrit und Fumarat zum Kulturmedium zugesetzt (Fig. 4-6). Parallel hierzu wurde untersucht, ob B. megaterium auch zur Fermentation in einem Medium ohne Zusatz dieser Elektronenakzeptoren fähig ist. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Erfindung wird dabei deutlich, daß der Elektronenakzeptor Nitrit eine toxische Wirkung auf das Bakterienwachstum ausübt. Auch Fumarat wirkt sich wachstumshemmend aus. Keiner der zugesetzten potentiellen Elektronenakzeptoren kann ein anaerobes Wachstum über das Maß des fermentativen Wachstums hinaus stimulieren.
5.6. Vergleichende Untersuchungen zur Vitamin B12 Produktion
Ferner wurden Analysen zur Vitamin B12 Produktion unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen von Bacillus megaterium durchgeführt. Erfindungsgemäß wurden beispielhaft die Stämme Bacillus megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894 unter anaeroben Bedingungen in Glukose-haltigem (LB-Voll)-Medium herangezogen und am Ende der exponentiellen Wachstumsphase der Vitamin B12 Gehalt in pmol/OD578 ermittelt. Parallel dazu wurde die Vitamin B12 Produktion bei aerober Lebensweise in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 wiedergegeben.
5.7. Einfluß von 5-Amino-Lävulinsäure (ALA) auf die Vitamin B12 Produktion
Da ein zentraler Regulationspunkt im Tetrapyrrolbiosysntheseweg zur Synthese von Vitamin B12 die Bildung von 5-Amino-Lävulinsäure (ALA) ist, wurde erfindungsgemäß der Einfluß von ALA auf die Vitamin B-12 Produktion im Bacillus megaterium untersucht. Die aerobe Vitamin B-12 Produktion von B. megaterium mit und ohne externe Zugabe von ALA ist in Fig. 8 dargestellt. Dabei wurden ALA- Konzentrationen von etwa 50 µg/ml Kulturmedium eingesetzt.
Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß sowohl bei aerober als auch bei anaerober Fermentation des Bakteriums die Zugabe von ALA keinen Effekt auf die Vitamin B-12 Produktion hat. Aufgrund dessen scheint die Regulation der Vitamin B- 12 Biosynthese nicht alleine durch die Bildung von ALA limitiert zu sein.
5.8. Quantitative Vitamin B12-Analyse
Aerobe B. megaterium-Kulturen wurden in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase, anaerobe Kulturen am Ende der exponentiellen Wachstumsphase nach Bestimmung der OD578 durch 15-minütiges Abzentrifugieren bei 5000 rpm geerntet (Centrifuge 5403, Eppendorf). Nach Waschen mit 40 ml Salzlösung wurde erneut 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Die erhaltenen Zellsedimente wurden abschließend lyophilisiert. S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten (Raux, E. et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 753-767) wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37°C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer Salzlösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Salzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48°C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt. 10 µl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten B. megaterium-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37°C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellenkolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin B12 der aufgetragenen B. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01, 0.1, 1, 10 und 40 pmol Vitamin B12, wurde auf den Gehalt an Vitamin B12 in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B12-Mengen in biologischen Materialien.
6. Molekularbiologische Techniken
Allgemeine Techniken, wie DNA-Präparation, Restriktion von DNA, Ligation, PCR, Sequenzierung, funktionelle Komplementation, Proteinexpression etc gehören zur gängigen Laborpraxis und sind bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben.
6.1. Protoplastentransformation von Bacillus megaterium
Protoplastenpreparation:
50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium angeimpft und bei 37°C inkubiert. Bei einer OD578 von 1 wurden die Zellen bei 15,000 rpm und 4°C 15 min abzentrifugiert (RC 5B Plus, Sorvall) und in 5 ml SMMP- Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37°C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 rpm und Rt (Centrifuge 5403, Eppendorf) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP- Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10% (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80°C eingefroren werden.
Transformation:
500 µl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 µg DNA in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension bei 3000 rpm und Rt für 10 min zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 µl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50-200 µl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach zweitägiger Inkubation bei 37°C sichtbar.
6.2. Identifizierung und Sequenzierung des hemAXCDBL-Operons aus B. megaterium
Zur Klonierung des hemAXCDBL-Operons wurde die Strategie der funktionellen Komplementation häm-auxotropher E. coli-Mutanten gewählt. Dazu wurde eine B. megaterium-Genbank nach gängigen Methoden hergestellt. Durch funktionelle Komplementation der E. coli hemB-Mutante RP523 mit dieser genomischen B. megaterium Plasmidgenbank konnten Kolonien isoliert werden, die wieder zur vollkommenen Tetrapyrrolbiosynthese befähigt waren, also phänotypisch den hämprototrophen Wildtyp darstellten. Nach Plasmid-DNA-Präparation und DNA- Sequenzierung der Vektor-lokalisierten B. megaterium-DNA konnte ein 3855 kb großes Insert identifiziert werden, das für das gesuchte hemAXCDBL Operon codiert. Die entsprechende Nukleotid-Sequenz ist in SEQ ID No. 1 und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen in SEQ ID No. 2-6 aufgeführt.
Die Sequenzen stromauf und stromabwärts des durch funktionelle Komplementation erhaltenen DNA-Fragments wurden mit Hilfe des Vectorette TM-Systems der Firma Sigma Genosis erhalten. Hierzu wurde die Turbo-Pfu-DNA-Polymerase der Firma Strategene verwendet, die aufgrund ihrer proofreading Funktion eine äußerst geringe Fehlerquote aufweist.
6.3. Transformations- und Expressionssysteme
Geeignete Plasmide zur Transformation und Überexpression von Genen in B. megaterium sind pWH1510 und PWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320 (Rygus, T. et al., 1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599).
Das Kontrollplasmid pWH1510 enthält im unterbrochenen xylA-Leseraster eine spoVG-lacZ Fusion. SpoVG-lacZ bezeichnet dabei die Fusion aus einer sehr starken Ribosomen-Bindesequenz eines Sporulationsproteins aus B. subtilis (spoVG) mit dem für die β-Galaktosidase codierenden Gen (lacZ) aus E. coli. Dieses Plasmid ist damit hervorragend geeignet zur Untersuchung von Transformationseffizienzen und Überexpressionsbedingungen bei B. megaterium.
Das Plasmid pWH1520 fungiert als eigentlicher Klonierungs- und Expressionsvektor. Beide Vektoren weisen ein Tetracyclin- und eine Ampicillinresistenz sowie die für die Replikation in E. coli und Bacillus spp wichtigen Elemente auf. Damit sind sie zugänglich für alle in E. coli etablierten Techniken für Abkömmlinge des Plasmids pBR322. Beiden Vektoren enthalten die B. megaterium xylA- und xylR- Gene des xyl Operons mit ihren regulatorischen Sequenzen (Rygus, T. et al., 1991, Molecular Cloning, Structure; Promoters and Regulatory Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol. 155, 535-542). XylA codiert für die Xyloseisomerase, während xylR für ein Regulatorprotein codiert, das eine starke transkriptionelle Kontrolle auf xylA ausübt. XylA wird reprimiert in Abwesenheit von Xylose. Bei Zugabe von Xylose kommt es zu einer ca. 200-fachen Induktion durch Derepression von xylA. Mit Hilfe eines Polylinkers im xylA-Leseraster wird eine Fusion von Genen mit xylA möglich, die dann ebenfalls unter der starken transkriptionellen Kontrolle von XylR stehen. Dabei kann man zwischen den Alternativen zur Bildung einer Transkriptions- oder Translationsfusion wählen, da das xylA-Leseraster stromaufwärts des Polylinkers noch vollkommen intakt ist.
Legende zu den Figuren
Es wurden Bakterienstämme und Plasmide gemäß den Tabellen 1 und 2 eingesetzt.
Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme
Tabelle 2: Verwendete Plasmide
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert.
Fig. 1 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSMZ32 (Wildtyp) bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 2 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSM509 bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSM2894 bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 4 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM32 (Wildtyp) bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 5 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM509 bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 6 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM2894 bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 7 zeigt die Vitamin B12-Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen. Es wurde der Gehalt an Vitamin B12 pro Zeilmasse angegeben in pmol/OD578 für den Wildtypstamm B. megaterium DSM32 aerob gewachsen (1) und anaerob gewachsen (2), für B. megaterium DSM509 aerob gewachsen (3) und anaerob gewachsen (4), sowie für B. megaterium DSM2894 aerob gewachsen (5) und anaerob gewachsen (6), bestimmt.
Fig. 8 zeigt die aerobe Vitamin B12-Produktion von B. megaterium mit und ohne externe Zugabe von 50 µg/ml ALA. Es wurde der Gehalt an Vitamin B12 pro Zellmasse, gemessen in pmol/OD578, für den Wildtypstamm B. megaterium DSM32 ohne ALA-Zugabe (1), mit ALA-Zugabe (2), für B. megaterium DSM509 ohne ALA- Zugabe (3), mit ALA-Zugabe (4), sowie für B. megaterium DSM2894 ohne ALA- Zugabe (5) und mit ALA-Zugabe (6), bestimmt. Tabelle 1
kp^^Hier, viel Spaß beim lesen. :D
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium.
Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B12 indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L., 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin B12 erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin B12-Biosynthese sind 5'- Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B12) und Methylcobalamin (MeCbl), während Vitamin B12 per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin B12 einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle.
Die Spezies B. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von 2 × 5 µm, einem G+C-Gehalt von ca. 38% und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge an B. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in B. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an B. megaterium (Priest, F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporen-bildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer-negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von B. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z. B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann B. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Die Vorteile der breiten Anwendung von B. megaterium bei der industriellen Produktion verschiedenster Enzyme, Vitamine etc. sind vielfältig. Dazu gehört zum ersten sicherlich der Umstand, daß in B. megaterium transformierte Plasmide sich als sehr stabil erweisen. Dies muß in direktem Zusammenhang gesehen werden mit der mittlerweile etablierten Möglichkeit, diese Spezies beispielsweise durch Polyethylenglykolbehandlung zu transformieren. Dies war bis vor wenigen Jahren noch ein Haupthindernis der Anwendung von B. megaterium als Produktionsstamm. Parallel hierzu ist auch der Vorteil einer relativ gut entwickelten Genetik zu sehen, die innerhalb des Bacillus-Genus nur von B. subtilis übertroffen wird. Zweitens weist B. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß B. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezerniert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und β-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit B. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, bis eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels B. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von B. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß B. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird B. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von α- und β-Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin B12-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Aufgrund seiner vielfältigen Vorteile zum Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte ist der Einsatz von Bacillus megaterium wirtschaftlich sehr interessant.
Bei der industriellen Fermentation aerober Mikroorganismen treten jedoch im großtechnischen Maßstab regelmäßig Probleme, insbesondere bei der effizienten Sauerstoffdurchlüftung der Bakterienkulturen auf, die mit erheblichen Verlusten in der Produktausbeute verbunden sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Herstellung von Vitamin B12 mit Bacillus megaterium zu optimieren.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend Bacillus megaterium gelöst, bei welchem die Fermentation unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird.
Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung alle üblichen B. megaterium-Stämme eingesetzt werden, die als Vitamin B12-Produktionsstämme geeignet sind.
Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Bacillus megaterium-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894.
Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß B. megaterium zu einer anaeroben Lebensweise fähig ist und außerdem unter diesen Bedingungen die Vitamin B12 Produktion höher ist, als unter aeroben Bedingungen. Der Vergleich der Vitamin B12 Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen zeigt deutlich, daß die anaerobe Vitamin B12 Produktion bei allen untersuchten Stämmen gegenüber der aeroben Vitamin B12 Produktion wenigstens um den Faktor 3 bis 4 gesteigert ist. Weitere Steigerungen lassen sich durch eine systematische Optimierung der Wachstumsbedingungen und der Zusammensetzung des Kulturmediums sowie der eingesetzten Bakterienstämme erreichen.
Erfindungsgemäß kann die Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium beispielsweise dadurch gesteigert werden, daß dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. Auch der Zusatz von beispielsweise Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder deren Kombinationen wirkt sich vorteilhaft auf die Vitamin B12 Produktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus. Vorteilhaft können auch die zuvor genannten Verbindungen einzeln oder deren Kombinationen in Kombination mit Cobalt sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß auch ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, das dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. D. h. Cobalt kann beispielsweise einzeln oder in Kombination mit wenigstens Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder Kombinationen der zuletzt genannten Verbindungen zugesetzt werden.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Vitamin B-12 Gehalt durch die Zugabe von etwa 200 bis 750 µM, vorzugsweise 250 bis 500 µM Cobalt pro Liter Kulturmedium angehoben werden.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der zuvor genannten Art umfasst, bei dem B. megaterium zunächst aerob und anschließend anaerob fermentiert wird. In einer vorteilhaften Variante erfolgt der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der Mitte oder am Ende, bevorzugt am Ende, der exponentiellen Wachstumsphase der aerob wachsenden Zellen erfolgt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei ein Verfahren, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte, wenigstens jedoch eine optische Dichte von etwa 2 bis 3 erreicht hat.
Unter anaeroben Bedingungen, sowohl in dem einstufigen, als auch in dem zweistufigen erfindungsgemäßen Verfahren, sind im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. Der Zeitpunkt der Überführung in die Anaerobierflaschen erfolgt insbesondere bei dem zweistufigen Verfahren, sobald sich die aerob angezüchteten Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. D. h. nach der Überführung in die Anaerobierflaschen verbrauchen die Bakterien den dort vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semianaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt.
Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi-anaerobe Bedingungen einstellen.
In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden.
Generell ist für eine erfindungsgemäße Fermentation unter anaeroben Bedingungen (ob nun semi-anaerob oder strikt anaerob), eine aerobe Anzucht (Vorkultur) der Bakterien nicht zwingend erforderlich. D. h. die Bakterien können auch unter anaeroben Bedingungen angezüchtet werden und anschließend unter semianaeroben oder strikt anaeroben Bedingungen weiter fermentiert werden. Denkbar ist auch, daß das Inocculum direkt aus der Stammhaltung entnommen und zur Herstellung von Vitamin B12 unter anaeroben Bedingungen eingesetzt wird.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Fermentierung unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von etwa 250 µM Cobalt; unter anaeroben Bedingungen ist ein Zusatz von etwa 500 µM Cobalt vorteilhaft.
Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenese oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u. a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B-12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin B12-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechselflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z. B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die entsprechenden Nukleotidsequenzen, kodierend für die an der Biosynthese von Vitamin B12 beteiligten Enzyme. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch eine isolierte Nukleotidsequenz kodierend für die an der Biosynthese von Uroporphyrinogen III beteiligten Enzyme, organisiert in dem hemAXCDBL-Operon aus B. megaterium mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder deren Allele. Erfindungsgemäß sind auch die durch das hemAXCDBL-Operon aus B. megaterium kodierten Enzyme mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No. 2-6 sowie Isoenzyme oder modifizierte Formen davon umfaßt.
Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.
Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Genstruktur enthaltend die isolierte Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder Teile davon, sowie operativ damit verknüpfte Nukleotidsequenzen mit regulatorischer Funktion.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier das β-Galakosidase- oder Arabinose-System genannt.
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind.
Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Vektor enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder Teile davon oder eine Genstruktur der zuvor genannten Art, sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, Replikation in der Wirtszelle und/oder Integration in das Wirtszellgenom. Beispiele für solche zusätzlichen Sequenzen sind in der Literatur zahlreich beschrieben und werden nicht weiter ausgeführt.
Geeignete Systeme für die Transformationen und Überexpressionen der erwähnten Gene in B. megaterium sind beispielsweise die Plasmide pWH1510 und pWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320, die bei Rygus, T. et al. (1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599) beschrieben sind. Die Plasmide sind auch kommerziell erhältlich (Q-biogene und MoBiTec). Die genannten Systeme sind jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß ein Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen hemAXCDBL-Operon oder Teile davon verstärkt exprimiert wird/werden.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren umfasst, bei dem ein genetisch veränderter Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen hemAXCDBL-Operon oder Teile davon gegenüber dem genetisch nicht veränderten Bacillus in erhöhter Kopienzahl in der Zelle vorliegt/vorliegen. Die Anzahl der Kopien kann zwischen 2 bis mehrere hundert variieren.
Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern.
Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen und/oder im Chromosom integriert und/oder amplifiziert sein.
Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm zum Einsatz in ein Verfahren zur Vitamin-B12-Herstellung der zuvor genannten Art, der eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl der Nukleotidsequenz des hemAXCDBL-Operons oder Teile davon aufweist. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm, der in replizierender Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor erwähnten Art enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz des hemAXCDBL-Operons oder Teile davon oder der Genstruktur oder eines Vektors der zuvor genannten Art zur Herstellung eines transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor erwähnten Art. Die vorliegende Erfindung schießt auch die Verwendung des transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor genannte Art zur Herstellung von Vitamin B12 ein.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Sie wirken sich jedoch nicht limitierend auf die Erfindung aus. 1. Chemikalien und molekularbiologische Agenzien DNA-Isolations-Kit Qiagen
Fast-Link Ligation Kit Biozym
Molekularbiologische Enzyme Amersham-Pharmacia, NEN-LifeScience
Wachstumsmedien Difco
2. Bakterienstämme und Plasmide
Alle in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. K2HPO4 60.3 mM KH2PO4 33.1 mM (NH4)2SO4 7.6 mM Natriumcitrat 1.7 mM MgSO4 1.0 mM D-Glucose 10.1 mM Thiamin 3.0 µM Casaminoacids 0.025% (w/v)
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Mopso (pH 7.0) 50.0 mM Tricin (pH 7.0) 5.0 mM MgCl2 520.0 µM K2SO4 276.0 µM FeSO4 50.0 µM CaCl2 1.0 mM MnCl2 100.0 µM NaCl 50.0 mM KCl 10.0 mM K2HPO4 1.3 mM (NH4)6Mo7O24 30.0 pM H3BO3 4.0 nM CoCl2 300.0 pM CuSO4 100.0 pM ZnSO4 100.0 pM D-Glucose 20.2 mM NH4Cl 37.4 mM Titrationsreagenz war KOH-Lösung.
NaCl 8.6 mM Na2HPO4 33.7 mM KH2PO4 22.0 mM NH4Cl 18.7 mM D-Glucose 20.2 mM MgSO4 2.0 mM CaCl2 0.1 mM
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g/l, Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCl2 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
PEG 6000 40.0% (w/v) Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCl2 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
Saccharose 300.0 mM Mops (pH 7.3) 31.1 mM NaOH 15.0 mM L-Prolin 52.1 mM D-Glucose 50.5 mM K2SO4 1.3 mM MgCl2 × 6 H2O 45.3 mM KH2PO4 313.0 µM CaCl2 13.8 mM Agar-Agar 4.0 g/l, Casaminoacids 0.2 g/l Hefe-Extrakt 10.0 g/l Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
4. Medien und Medienzusätze 4.1 Medien
Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, gearbeitet.
4.2. Zusätze
Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren oder Antibiotika wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50°C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen, wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende:
Ampicillin 296 µM Tetracyclin 21 µM ALA 298 µM Häm 153 µM X-Gal 98 µM Methionin 335 µM Cystein 285 µM Natriumnitrat 10 mM Natriumnitrit 10 mM Dinatriumfumarat 10 mM Glucose 10 mM Ammoniumchlorid 37 mM Xylose 33 mM Lysozym 10 µg/ml Casaminoacids 0.025% (w/v)
5. Mikrobiologische Techniken 5.1. Sterilisation
Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für 20 min bei 120°C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert, Glaswaren mindestens 3 h bei 180°C hitzesterilisiert.
5.2. Allgemeine Wachstumsbedingungen
Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37°C und einer minimalen Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert.
5.3. Bedingungen für Bacillus megaterium Wachstum
Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und, falls nicht anders angegeben, bei 30°C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 100 ml in kleinen Anaerobenflaschen bei 30°C und 100 rpm fermentiert. In beiden Fällen wurde auf die Verwendung qualitativ konstanter Medien, Animpfung im Verhältnis 1 : 100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet.
5.4. Bestimmung der Zelldichte
Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, daß einer OD578 von eins eine Zellzahl von 1 × 109 Zellen entspricht.
5.5. Vergleichende Wachstumsuntersuchungen
Es wurden vergleichende Untersuchungen zum aeroben und anaroben Wachstumsverhalten verschiedener Bacillus megaterium-Stämme durchgeführt, die in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt sind. Bei den eingesetzten Stämmen handelt es sich um die Stämme B. megaterium DSMZ 32 (Wildtyp) oder die unter aeroben Bedingungen zur Vitamin B12-Produktion geeigneten "Produktionsstämme" DSMZ 509 und DSMZ 2894. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz dieser Stämme limitiert. Denkbar sind auch andere zur Herstellung von Vitamin B12 geeignete Stämme, eingeschlossen genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenesen oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können.
Bei den Untersuchungen, inwieweit B. megaterium zum anaeroben Wachstum befähigt ist, wurden anstelle des aeroben Elektronenakzeptors Sauerstoff, die alternativen Elektronenakzeptoren Nitrat, Nitrit und Fumarat zum Kulturmedium zugesetzt (Fig. 4-6). Parallel hierzu wurde untersucht, ob B. megaterium auch zur Fermentation in einem Medium ohne Zusatz dieser Elektronenakzeptoren fähig ist. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Erfindung wird dabei deutlich, daß der Elektronenakzeptor Nitrit eine toxische Wirkung auf das Bakterienwachstum ausübt. Auch Fumarat wirkt sich wachstumshemmend aus. Keiner der zugesetzten potentiellen Elektronenakzeptoren kann ein anaerobes Wachstum über das Maß des fermentativen Wachstums hinaus stimulieren.
5.6. Vergleichende Untersuchungen zur Vitamin B12 Produktion
Ferner wurden Analysen zur Vitamin B12 Produktion unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen von Bacillus megaterium durchgeführt. Erfindungsgemäß wurden beispielhaft die Stämme Bacillus megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894 unter anaeroben Bedingungen in Glukose-haltigem (LB-Voll)-Medium herangezogen und am Ende der exponentiellen Wachstumsphase der Vitamin B12 Gehalt in pmol/OD578 ermittelt. Parallel dazu wurde die Vitamin B12 Produktion bei aerober Lebensweise in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 wiedergegeben.
5.7. Einfluß von 5-Amino-Lävulinsäure (ALA) auf die Vitamin B12 Produktion
Da ein zentraler Regulationspunkt im Tetrapyrrolbiosysntheseweg zur Synthese von Vitamin B12 die Bildung von 5-Amino-Lävulinsäure (ALA) ist, wurde erfindungsgemäß der Einfluß von ALA auf die Vitamin B-12 Produktion im Bacillus megaterium untersucht. Die aerobe Vitamin B-12 Produktion von B. megaterium mit und ohne externe Zugabe von ALA ist in Fig. 8 dargestellt. Dabei wurden ALA- Konzentrationen von etwa 50 µg/ml Kulturmedium eingesetzt.
Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß sowohl bei aerober als auch bei anaerober Fermentation des Bakteriums die Zugabe von ALA keinen Effekt auf die Vitamin B-12 Produktion hat. Aufgrund dessen scheint die Regulation der Vitamin B- 12 Biosynthese nicht alleine durch die Bildung von ALA limitiert zu sein.
5.8. Quantitative Vitamin B12-Analyse
Aerobe B. megaterium-Kulturen wurden in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase, anaerobe Kulturen am Ende der exponentiellen Wachstumsphase nach Bestimmung der OD578 durch 15-minütiges Abzentrifugieren bei 5000 rpm geerntet (Centrifuge 5403, Eppendorf). Nach Waschen mit 40 ml Salzlösung wurde erneut 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Die erhaltenen Zellsedimente wurden abschließend lyophilisiert. S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten (Raux, E. et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 753-767) wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37°C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer Salzlösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Salzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48°C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt. 10 µl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten B. megaterium-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37°C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellenkolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin B12 der aufgetragenen B. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01, 0.1, 1, 10 und 40 pmol Vitamin B12, wurde auf den Gehalt an Vitamin B12 in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B12-Mengen in biologischen Materialien.
6. Molekularbiologische Techniken
Allgemeine Techniken, wie DNA-Präparation, Restriktion von DNA, Ligation, PCR, Sequenzierung, funktionelle Komplementation, Proteinexpression etc gehören zur gängigen Laborpraxis und sind bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben.
6.1. Protoplastentransformation von Bacillus megaterium
Protoplastenpreparation:
50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium angeimpft und bei 37°C inkubiert. Bei einer OD578 von 1 wurden die Zellen bei 15,000 rpm und 4°C 15 min abzentrifugiert (RC 5B Plus, Sorvall) und in 5 ml SMMP- Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37°C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 rpm und Rt (Centrifuge 5403, Eppendorf) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP- Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10% (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80°C eingefroren werden.
Transformation:
500 µl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 µg DNA in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension bei 3000 rpm und Rt für 10 min zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 µl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50-200 µl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach zweitägiger Inkubation bei 37°C sichtbar.
6.2. Identifizierung und Sequenzierung des hemAXCDBL-Operons aus B. megaterium
Zur Klonierung des hemAXCDBL-Operons wurde die Strategie der funktionellen Komplementation häm-auxotropher E. coli-Mutanten gewählt. Dazu wurde eine B. megaterium-Genbank nach gängigen Methoden hergestellt. Durch funktionelle Komplementation der E. coli hemB-Mutante RP523 mit dieser genomischen B. megaterium Plasmidgenbank konnten Kolonien isoliert werden, die wieder zur vollkommenen Tetrapyrrolbiosynthese befähigt waren, also phänotypisch den hämprototrophen Wildtyp darstellten. Nach Plasmid-DNA-Präparation und DNA- Sequenzierung der Vektor-lokalisierten B. megaterium-DNA konnte ein 3855 kb großes Insert identifiziert werden, das für das gesuchte hemAXCDBL Operon codiert. Die entsprechende Nukleotid-Sequenz ist in SEQ ID No. 1 und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen in SEQ ID No. 2-6 aufgeführt.
Die Sequenzen stromauf und stromabwärts des durch funktionelle Komplementation erhaltenen DNA-Fragments wurden mit Hilfe des Vectorette TM-Systems der Firma Sigma Genosis erhalten. Hierzu wurde die Turbo-Pfu-DNA-Polymerase der Firma Strategene verwendet, die aufgrund ihrer proofreading Funktion eine äußerst geringe Fehlerquote aufweist.
6.3. Transformations- und Expressionssysteme
Geeignete Plasmide zur Transformation und Überexpression von Genen in B. megaterium sind pWH1510 und PWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320 (Rygus, T. et al., 1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599).
Das Kontrollplasmid pWH1510 enthält im unterbrochenen xylA-Leseraster eine spoVG-lacZ Fusion. SpoVG-lacZ bezeichnet dabei die Fusion aus einer sehr starken Ribosomen-Bindesequenz eines Sporulationsproteins aus B. subtilis (spoVG) mit dem für die β-Galaktosidase codierenden Gen (lacZ) aus E. coli. Dieses Plasmid ist damit hervorragend geeignet zur Untersuchung von Transformationseffizienzen und Überexpressionsbedingungen bei B. megaterium.
Das Plasmid pWH1520 fungiert als eigentlicher Klonierungs- und Expressionsvektor. Beide Vektoren weisen ein Tetracyclin- und eine Ampicillinresistenz sowie die für die Replikation in E. coli und Bacillus spp wichtigen Elemente auf. Damit sind sie zugänglich für alle in E. coli etablierten Techniken für Abkömmlinge des Plasmids pBR322. Beiden Vektoren enthalten die B. megaterium xylA- und xylR- Gene des xyl Operons mit ihren regulatorischen Sequenzen (Rygus, T. et al., 1991, Molecular Cloning, Structure; Promoters and Regulatory Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol. 155, 535-542). XylA codiert für die Xyloseisomerase, während xylR für ein Regulatorprotein codiert, das eine starke transkriptionelle Kontrolle auf xylA ausübt. XylA wird reprimiert in Abwesenheit von Xylose. Bei Zugabe von Xylose kommt es zu einer ca. 200-fachen Induktion durch Derepression von xylA. Mit Hilfe eines Polylinkers im xylA-Leseraster wird eine Fusion von Genen mit xylA möglich, die dann ebenfalls unter der starken transkriptionellen Kontrolle von XylR stehen. Dabei kann man zwischen den Alternativen zur Bildung einer Transkriptions- oder Translationsfusion wählen, da das xylA-Leseraster stromaufwärts des Polylinkers noch vollkommen intakt ist.
Legende zu den Figuren
Es wurden Bakterienstämme und Plasmide gemäß den Tabellen 1 und 2 eingesetzt.
Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme
Tabelle 2: Verwendete Plasmide
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert.
Fig. 1 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSMZ32 (Wildtyp) bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 2 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSM509 bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSM2894 bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 4 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM32 (Wildtyp) bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 5 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM509 bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 6 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM2894 bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Fig. 7 zeigt die Vitamin B12-Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen. Es wurde der Gehalt an Vitamin B12 pro Zeilmasse angegeben in pmol/OD578 für den Wildtypstamm B. megaterium DSM32 aerob gewachsen (1) und anaerob gewachsen (2), für B. megaterium DSM509 aerob gewachsen (3) und anaerob gewachsen (4), sowie für B. megaterium DSM2894 aerob gewachsen (5) und anaerob gewachsen (6), bestimmt.
Fig. 8 zeigt die aerobe Vitamin B12-Produktion von B. megaterium mit und ohne externe Zugabe von 50 µg/ml ALA. Es wurde der Gehalt an Vitamin B12 pro Zellmasse, gemessen in pmol/OD578, für den Wildtypstamm B. megaterium DSM32 ohne ALA-Zugabe (1), mit ALA-Zugabe (2), für B. megaterium DSM509 ohne ALA- Zugabe (3), mit ALA-Zugabe (4), sowie für B. megaterium DSM2894 ohne ALA- Zugabe (5) und mit ALA-Zugabe (6), bestimmt. Tabelle 1
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
05.05.2009 um 23:54@open-mind
nein düster ist die zukunft nicht nur es wird nicht das werden was man glaubt oder hofft und es wird sich meiner meinung nach nicht darum drehen das alle menschen an einem strang ziehen werden
nein düster ist die zukunft nicht nur es wird nicht das werden was man glaubt oder hofft und es wird sich meiner meinung nach nicht darum drehen das alle menschen an einem strang ziehen werden
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
05.05.2009 um 23:57@Vymaanika
Unverschämte Massenhaltung der Bakterien durch den Menschen zum Nutzen des Menschen. Scheußlich. Einfach scheußlich. Die Bakterien sollten frei leben dürfen, in ihrem natürlichen Lebensraum und nicht dafür missbraucht werden, die menschliche Vitamin B12 Zuvor zu befriedigen.
Wer gibt dem Menschen nur das Recht, sich an den armen Bakterien zu vergreifen?!
Unverschämte Massenhaltung der Bakterien durch den Menschen zum Nutzen des Menschen. Scheußlich. Einfach scheußlich. Die Bakterien sollten frei leben dürfen, in ihrem natürlichen Lebensraum und nicht dafür missbraucht werden, die menschliche Vitamin B12 Zuvor zu befriedigen.
Wer gibt dem Menschen nur das Recht, sich an den armen Bakterien zu vergreifen?!
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
05.05.2009 um 23:58@Gruselschinken ja aber so funktioniert nun mal der kapitalismus entweder top oder flop so ist das und da es keine polypole gibt was optimal für den kapitalismus ist, und daher ist es so wie es ist
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 00:01@Bukowski
Du solltest weniger Wein genießen um die Uhrzeit, immerhin gibt es sicher morgen eine interessante Vorlesung für dich. ;)
Ansonsten ist der Rest natürlich Unsinn...
Du solltest weniger Wein genießen um die Uhrzeit, immerhin gibt es sicher morgen eine interessante Vorlesung für dich. ;)
Ansonsten ist der Rest natürlich Unsinn...
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06.05.2009 um 00:02Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 00:04@Vymaanika
na komm erzähle mir mal einen sinnvoll funktionierenden wirtschaftskreislauf und dann kannst du noch mal anfangen sinnfreie dinge zu schreiben
na komm erzähle mir mal einen sinnvoll funktionierenden wirtschaftskreislauf und dann kannst du noch mal anfangen sinnfreie dinge zu schreiben
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 00:11bla^^
Deswegen immer schön zum Media-Markt rennen und billige Elektronik aus fernost kaufen, dazu die billige Mainstreameinrichtung von Ikea bewundern, Freund einladen, die einem das Ego streicheln, was man doch für tolle Sachen hat, anschließend zusammen bei Billigfleisch aus Massentierhaltung zusammensitzen und Billigwein aus Frankreich schlabbern.Jo, Kapitalismus macht frei.^^freydank schrieb:ja aber so funktioniert nun mal der kapitalismus entweder top oder flop so ist das und da es keine polypole gibt was optimal für den kapitalismus ist, und daher ist es so wie es ist
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06.05.2009 um 00:11@Vymaanika
Weshalb?Vymaanika schrieb:Ansonsten ist der Rest natürlich Unsinn...
Nein, im Gegenteil. :D
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 00:12@Vymaanika
ich schätze aus deiner aussage das du nicht einmal verstanden hast was ich geschrieben habe
ich schätze aus deiner aussage das du nicht einmal verstanden hast was ich geschrieben habe
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 00:26hab grad ein toolles Zitat gefunden zum Thema ;)
"Alle Leute, die Fleisch essen, gehören des Landes verwiesen." -
Morrissey, in der britischen Zeitschrift »Smash Hits« vom 1. Januar 1986.
Wäre doch mal eine ganz neue Zusammensetzung von Ländern, statt Staatsangehörigkeiten, die Leutchen nach Vegetarismus/Fleischkonsum einteilen
Wo würde wohl Überbevölkerung herrschen ? ;) --
Vielleicht würden dann auch so Touristenfahrten organisiert, nach dem Motto:
Fahrt ins Grüne, Besichtigung der barbarischen Fleischkonsumenten in einem typischen Restaurant, mit dem nötigen Sicherheitsabstand ;D
weiss nur nicht, was ich als Fischesser dann machen soll = ;)
"Alle Leute, die Fleisch essen, gehören des Landes verwiesen." -
Morrissey, in der britischen Zeitschrift »Smash Hits« vom 1. Januar 1986.
Wäre doch mal eine ganz neue Zusammensetzung von Ländern, statt Staatsangehörigkeiten, die Leutchen nach Vegetarismus/Fleischkonsum einteilen
Wo würde wohl Überbevölkerung herrschen ? ;) --
Vielleicht würden dann auch so Touristenfahrten organisiert, nach dem Motto:
Fahrt ins Grüne, Besichtigung der barbarischen Fleischkonsumenten in einem typischen Restaurant, mit dem nötigen Sicherheitsabstand ;D
weiss nur nicht, was ich als Fischesser dann machen soll = ;)
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 10:31@elfenpfad
Urlaub unter Wasser?
Ausser n paar Songs fand ich Morrissey bis jetzt net sooooo prickelnd
Deine Wohnungseinrichtung haste dir vom Schreiner maßanfertigen lassen?
Und Wein... ach neee ich vergaß du bist ja veganer und trinkst daher sicher keinen wein :D
Urlaub unter Wasser?
Ausser n paar Songs fand ich Morrissey bis jetzt net sooooo prickelnd
Also funktioniert bei dir der PC mit Dampf?
Deine Wohnungseinrichtung haste dir vom Schreiner maßanfertigen lassen?
Und Wein... ach neee ich vergaß du bist ja veganer und trinkst daher sicher keinen wein :D
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 10:37Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 10:41Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 10:44@klarabella
zustimm
zustimm
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 11:14Nicht nur Rebläuse, zur Filterung des Weins wird oft Eiklar, Gelatine oder eine Hausenblase verwendet.
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 11:21@klarabella
Habe ich erwähnt, dass es sich um veganen Wein handelt? :P
Habe ich erwähnt, dass es sich um veganen Wein handelt? :P
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 11:25@freydank
Und irgendwann muss/wird die Menschheit aufwachen und begreifen, dass alles EINS ist. Und dann werden ALLE an einem Strang ziehen.
Also ich gestalte mir meine Zukunft selber. ;)
Und irgendwann muss/wird die Menschheit aufwachen und begreifen, dass alles EINS ist. Und dann werden ALLE an einem Strang ziehen.
Vegetarier / Veganer vs. Fleischesser
06.05.2009 um 11:28
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